心脏肌钙蛋白是最重要的心脏病标志物
在心脏肌钙蛋白（Troponin）被发现和使用之前，乳糖脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH），肌酸激酶（creatine kinase,CK），肌酸激酶同工酶分析（CK-MB）,以及肌红蛋白检测被用于心肌梗死造成的心脏损伤。但这些标志物的特异性较弱，因而运用受到较多限制。大量研究事实证明（参考文献1），与上述这些生物标志物相比，肌钙蛋白具备出色的心脏特异性。肌钙蛋白是造成肌肉收缩功能的重要蛋白质，主要包括肌钙蛋白C、肌钙蛋白T与肌钙蛋白I三种，其中T型和I型具有心脏特异性，而C型与心肌和骨骼肌都相关。所以，在心脏病诊断中主要使用的是T型和I型。两者与心脏病过程非常相关，特别是I型，在临床上使用甚广。不论对于临床前研究，还是临床药物研发，心脏肌钙蛋白都应该被作为最重要的心脏损伤的生物标志物来使用，美国的食品药品监督管理局（the Food and Drug Administration, FDA）和欧洲药监局（European Medicines Agency），都已接受将心脏肌钙蛋白作为新药申请的生物标志物。
经过多年的研究发展，心脏肌钙蛋白是急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction）的关键诊断或排除标准。2007年欧洲心脏病协会（ESC），美国心脏病基金会（ACC），美国心脏协会（AHA）及世界心脏联盟（WHF）达成联合共识，建立了心肌梗塞的关键标准：将心肌梗塞诊断推荐的检测阈值（cutoff）定义为对照健康人群检测值的第99百分位，并且在此阈值时检测不精密度（imprecision），即CV≤10%（参考文献2）。
心脏肌钙蛋白检测技术对比
尽管有大量不同技术方法可以检测肌钙蛋白，但是，如何定义对照健康人群的方式，例如年龄，种族，性别，以及样本量的要求都没有广泛的共识，每个试剂盒供应商都会在说明书中所描述的第99百分位阈值，因为样本量的大小和组织情况经常没有非常清晰的描述，所以数据质量和对比都缺乏足够的可信度和依据。为此Fred S Apple在2012年领导了一项重要工作，即利用超过500份健康对照的肝素抗凝血浆样本，对科研市场上所能获得的所有19种C型和T型肌钙蛋白检测技术，进行了横向对比试验。所横向对比的技术包括超高灵敏度检测技术，例如来自Abbot, Beckman, Roche, Siemens,以及Erenna单分子免疫检测平台，以及其他一些中等灵敏度和普通灵敏度的检测技术，结果发现Erenna平台在所有技术中拥有最高的检测下限，即0.09 pg/mL, 从而实现了100%的样品检出率。与此相对，其他超高灵敏度检测技术所能达到的最高灵敏度仅为0.5 pg/mL，样品检出百分率的中位数仅为72%，有大量健康个体的cTnI指标无法检测，因而很难实现第99百分位的阈值的测定。而普通技术例如酶联免疫分析等方法，健康个体的cTnI检出率仅为个位数（图1）。
图1.健康对照人群中19种不同心脏肌钙蛋白检测技术的第99百分位的阈值和灵敏度对比(Toxicologic Pathology, 2010)，红线标注的是Erenna单分子免疫检测平台得到的结果。
SMC检测平台针对检测的灵敏度需求和精度需求实现了前所未有的重大突破，检测灵敏度达到0.09pg/mL(参考文献3)，第99百分位的阈值达到8ng/L(参考文献4)。Erenna平台在针对检测性能的描述时所使用的检测灵敏度使用最严谨的检测指标，即LLoQ（Lower Limit of Quantification，要求在这个点时检测的回收率，即recovery 80%-120%, 且CV<20%），而并不是严谨度较低的平台灵敏度检测下限LoD(Limit of Detection, LOD)。,在商用试剂盒使用多物种抗体的条件下，LLoQ值可以达到0.4pg/mL, 而检测所覆盖的物种包括了人类，猴，大鼠，犬类，和豚鼠。在此灵敏度条件下，多达350位健康男性和女性对照样本所测得的第99百分位阈值是10.19pg/mL（图2）
SMC单分子免疫应用于心脏肌钙蛋白检测
SMC单分子免疫检测技术，系统所产生的激光高能光斑能够最有效地照射和激发单个荧光分子。SMC™单分子检测专利技术会检测区域的单个荧光信号，峰高超过阈值的荧光信号会被统计为数字信号，并将检测到的数字信号进行汇总，显著地提高了检测灵敏度。光闪烁信号的次数和强度与分子浓度呈正相关性，从而能建立标准曲线。通过对一定时间之内光闪烁信号进行统计，可以对溶液浓度进行定量检测。SMC单分子免疫检测技术是蛋白生物标志物检测领域的突破性新技术。首次实现了在单分子水平对蛋白进行计量，并造就了100-1000倍于ELISA技术的超高检测灵敏度。该技术的其他特性还包括宽至4个log的大动态检测范围以及可以方便的自行开发检测项目等。
图3. Erenna单分子检测技术原理
在一项长达12年的连续科研中，cTnI的价值被彻底地重新发现。研究者在12年前检测了正常个体的cTnI, 并且根据本底表达水平的差异将被测者分为4组。研究团队在随后12年的连续观察中发现，表达cTnI较高的个体有明显较高的累积心脏病发病率，能在12年后达到10%以上，而低于1.06pg/mL的正常人心脏病的累积发病率极低，不超过3%。人们对于cTnI这样的生物标志物的观点被彻底颠覆了：健康个体的cTnI本底表达水平决定了多年后的心脏病发病状态，这项检测对于心脏病的预测性作用被高度重视，目前已经成为美国心脏病检测领域的关键技术（图4）。
图4. 单分子检测技术通过健康个体cTnI预测心脏病累积发病率（Circulation, 2012）
总结
随着研究深入和文献体量的不断增加，不论对于临床前研究还是药物研发而言，心脏肌钙蛋白的重要性都不断提升。全新的高灵敏度检测技术为利用好这种重要的生物标志物提供了更高质量的数据和更高的样品检测效率。以单分子检测为代表的全新方法必然会为心脏病相关新药研发或诊疗技术的发展提供更多的机会。
参考文献
1. William J.R.et al, Toxicologic Pathology, 2010
2. Thygesen K et al, J Am Coll Cardiol 2007
3. Fred S.A.et al，Clin Chem 2012
4. Todd J et al, Clin Chem 2007
5. Wang T，et al. Circulation. 2012
